پایان نامه آنالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان ناحیه C2 پروتئین 166CD در میزبان پروکاریوتی
فهرست محتوا
فهرست مطالب
- چکیده فارسی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….1
- فصل اول مقدمه
- سرطان…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….2
- آناتومی روده بزرگ…………………………………………………………………………………………………………………………………………..4
- جنین شناسی روده بزرگ…………………………………………………………………………………………………………………………………..5
- 1-4 سرطان کولورکتال……………………………………………………………………………………………………………………………………………6
- 1-4-1 چه کسانی در معرض خطر هستند……………………………………………………………………………………………………………………7
- 1-4-2 عوامل محیطی………………………………………………………………………………………………………………………………………………..8
- 1-4-3 عوامل ژنتیکی………………………………………………………………………………………………………………………………………………8
- 1-4-4 عوانل دیگر در بروز سرطان………………………………………………………………………………………………………………………….8
- علائم و نشانها………………………………………………………………………………………………………………………………………….9
- 1-5 غربالگری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….9
- 1-6 تعیین مرحله بیماری………………………………………………………………………………………………………………………………………..10
- 1-7 روشهای درمانی……………………………………………………………………………………………………………………………………………12
- 1-7-1 درمان موضعی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..13
- 1-7-2 درمان سیستماتیک………………………………………………………………………………………………………………………………………..13
- 1-7-3 کولونوسکپی………………………………………………………………………………………………………………………………………………13
- لاپاراسکپی………………………………………………………………………………………………………………………………………………13
- 1-7-6 جراحی باز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………13
- 1-7-7 شیمی درمانی……………………………………………………………………………………………………………………………………………..14
- 1-7-8 درمان بیولوژیکی………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
- 1-7-9 پرتو درمانی………………………………………………………………………………………………………………………………………………..14
- 1-7-9-1 انواع درمان با اشعه………………………………………………………………………………………………………………………………….14
- 1-8 ALCAM……………………………………………………………………………………………………………………………………………………15
- 1-9 ویژگیهای عمومی ALCAM………………………………………………………………………………………………………………………….15
- 1-10 شناسایی ALCAM به عنوان یک هدف با انکولوژی………………………………………………………………………………………..16
- مساله تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….19
- فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
- 2-1 نقش ALCAM در درمان سرطان………………………………………………………………………………………………………………….20
- فصل سوم: مواد و روشها
- 3-1 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………………………………………………23
- 3-1-1 باکتری مورد استفاده …………………………………………………………………………………………………………………………………..23
- 3-1-2 پلاسمید ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………23
- 3-1-3 آنزیمها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23
- 3-1-4 کیتهای ازمایشگاهی. ………………………………………………………………………………………………………………………………24
- 3-1-5 انتی بیوتیک ها. ………………………………………………………………………………………………………………………………………….24
- 3-1-6 محیط کشت باکتری …………………………………………………………………………………………………………………………………..25
- 3-1-7 ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………………………………25
- 3-1-8 مواد شیمیایی. …………………………………………………………………………………………………………………………………………….25
- 3-1-9 وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی …………………………………………………………………………………………………………………..25
- 3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئین ALCAM. ………………………………………………………………………………………….29
- 3-2-1 استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM ………………………………………………………………………………………………29
- 3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization …………………………………………………………………………………………………………29
- 3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM ……………………………………………………………………………………………….29
- 3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب ……………………………………………………………………………………………………………………………..29
- 3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده ……………………………………………………………………………………………………..30
- 3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه………………………………………………………………………………………………………………………….30
- 3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM ………………………………………………30
- 3-4-1 آماده سازی باکتری شایسته…………………………………………………………………………………………………………………………..30
- 3-4-1-1 مواد و محلولها…………………………………………………………………………………………………………………………………….30
- 3-4-1-2 روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………………………30
- 3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلولهای مستعد TOP10 E.coli.. ………………………………………………………………..31
- 3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………………………..31
- 3-4-3 ارزیابی کلونیها………………………………………………………………………………………………………………………………………..32
- 3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه C2……………………………………………………………………..33
- 3-4-5 تأیید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………………………………………………………..35
- 3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion…………………………………………………………………………………………..35
- 3-4-5-2 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………………………………….35
- 3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2 پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………….37
- 3-5-1 تخلیص DNA ناحیه C2 از ژل………………………………………………………………………………………………………………….37
- 3-5-2 لایگیشن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38
- 3-5-3 ترانسفورماسیون………………………………………………………………………………………………………………………………………….39
- 3-5-3-1 آماده سازی سلولهای شایسته…………………………………………………………………………………………………………………39
- 3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلولهای شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………………40
- 3-5-4 ارزیابی کلونیها………………………………………………………………………………………………………………………………………..40
- 3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 پروتئین ALCAM……………………………………………………..41
- 3-5-6 تأیید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………………………………………………………..42
- 3-6 بیان پروتئین مولتی توپ EpCAM………………………………………………………………………………………………………………..43
- 3-6-1 القاء بیان پروتئین………………………………………………………………………………………………………………………………………..43
- 3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page…………………………………………………………………………………………………….43
- 3-6-2-1 روش ساخت محلولها و ژلها……………………………………………………………………………………………………………..44
- 3-6-2-2 Run کردن نمونهها……………………………………………………………………………………………………………………………..45
- 3-6-2-3 رنگ آمیزی با کوماسی G-250 کلوئیدی………………………………………………………………………………………………….45
- فصل چهارم: نتایج
- 4-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی ………………………………………………………………………………………………………………………….47
- ………………………………………………………………………………………………….50……………………..C2 ناحیه DNA4-2 سنتز شیمیایی
- 4-3 کلونینگ پلاسمید AMP+ -pBSK حاوی DNA ناحیه C2…………………………………………………………………………………….52
- 4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه C2……………………………………………………………………………………………………………………………….54
- 4-5 بیان پروتئین C2 و تأیید آن به کمک تکنیک SDS_page…………………………………………………………………………………………..57
- فصل پنجم:
- بحث……………………………………………………………………………….…………………………………………………………………………………………..59
- نتیجه گیری……………………………………………………………………………….………………………………………………………………………………….69
- منابع……………………………………………………………………………….……………………………………………………………………………………………71
- چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………….……………………………………………………………………………………74
چکیده:
همة سرطانها از سلولها شروع میشوند به طور طبیعی، سلولها به گونهای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد میکنند و تقسیم میشوند. سلولهای جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود میآیند و یا سلولهای پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه میدهند. این سلولهای اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل میدهند.
سرطان کولورکتال یکی از شایعترین سرطانهای بدخیم در سرتاسر جهان میباشد که میزان ابتلا به آن حدود 6/0 میباشد که منجر به مرگ 600 هزار نفر در سال میگردد..CD166 به عنوان مارکر سلولهای بنیادی سرطان کولورکتال شناسایی و معرفی شده است. که با توجه به بیان آن بر سطح سلولهای سرطان کولورکتال در مراحل مختلف بیماری میتوان از آن جهت کارهای درمانی و تشخیصی استفاده نمود.
ALCAM مارکر تشخیصی مثبتی برای بقای کلی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال میباشد و شناسایی آن ممکن است به بهینه سازی سیتسم مرحله بندی تشخیصی موجود کمک کند.ALCAM معمولاً در سرطان کولورکتال روشن بوده و مارکر تشخیصی مستقل جدیدی میباشد که بر اهمیتان در پیشروی تومور در سرطان کولورکتال تاکید شده است.
در این مطالعه ما ابتدا سعی بر آن داشتیم توالی مورد نظر را از بانکهای اطلاعاتی ژنی استخراج نماییم و سپس از طریق آنالیز بیوانفورماتیکی توالی مورد نظر را از نظر بهترین بیان در میزبان باکتریایی آماده نماییم. ژن مورد نظر از طریق شیمیایی سنتز شده و سپس با استفاده از فرایند کلونینگ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال داده و تکثیرنموده. در انتها نیز بیان ناحی C2 در باکتریهای نوترکیب با القاگر مناسب القا مینماییم و وجود پروتئین مورد نظر را به کمک تکنیک SDS-page مورد بررسی قرار میدهیم.
ناحیه C2 میتواند به مانند پروتئین اصلی خاصیت ایمنی زائی داشته باشد. این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین مورد نظر را تولید کند. از این جهت میتوان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین میتوان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت نمود.
واژههای کلیدی:
سرطان کولورکتال، ALCAM، ناحیه C2 پروتئین ALCAM، کلونینگ
فصل اول
مقدمه
1-1 سرطان چیست
اصطلاح سرطان به تومورهای اطلاق میشود که میتوانند به بافتهای مجاور خود که از سلولهای سالم تشکیل میشوند حمله کنند توانایی مجاورت و هجوم سلولهای توموری عامل طبقه بندی تومورها به دو دسته خوش خیم و بدخیم است اگر یک تومور بدخیم به یک رگ خونی یا لنفی[1] برسد میتواند متاستاز [2]دهد ودر بافتهای دیگری رشد کند. نئوپلاسم (که معنی آن رشد جدید است) شکل غیر طبیعی رشد سلولها است و تومور، نئپلاسمی است که با وضعیت بیمار گونه همراه است، تومورها بیماریهایی هستند که در آنها جمعیتی از سلولهای، که به لحاظ ژنتیکی هم خانواده هستند توانایی رشد نا به هنجار را کسب میکنند (نخعی سیستانی وهمکاران 1389). همة سرطانها از سلولها شروع میشوند که واحد سازنده بدن و اساس زندگی محسوب میشوند. سلولها بافت را میسازند و بافتهای بدن، اندامها را تشکیل میدهند. به طور طبیعی، سلولها به گونهای که بدن به آنها نیاز دارد، رشد میکنند و تقسیم میشوند. سلولهای پیر میمیرند وسلول های جدید جای آنها را میگیرند.
گاهی نظم مراحل رشد به هم میخورد. سلولهای جدید زمانی که لزومی به وجود آنها نیست، به وجود میآیند و یا سلولهای پیر در زمان مرگ به حیات خود ادامه میدهند. این سلولهای اضافی توده بافتی به نام تومور تشکیل میدهند.
تومورها خوش خیم یا بد خیم میباشند.
تومورهای خوش خیم سرطانی نیستند.
- این نوع تومورها به ندرت زندگی فرد را تهدید میکنند.
- بیشتر تومورهای خوش خیم قابل جراحی بوده و معمولاً عود نمیکنند.
- تومورهای خوش خیم، به بافتهای اطراف و سایر قسمتهای بدن گسترش نمییابند.
تومورهای بدخیم سرطانی هستند.
- عموماً این تومورها بسیار خطرناکتر از تومورهای خوش خیم بوده و زندگی فرد را تهدید میکنند.
- تومورهای بدخیم قابل جراحی بوده ولی در مواردی بعد از عمل جراحی مجدداً عود میکنند.
- تومورهای بدخیم انتشار یافته و به بافتها و اعضای مجاور، آسیب میرسانند.
- سلولهای سرطانی از بافت توموری جدا شده و با وارد شدن در جریان خون یا سیستم لنفاوی، تومورهای جدیدی درسایراعضاء بدن تشکیل میدهند. گسترش و انتشار سلولهای سرطانی به سایر بافتهای بدن را متاستاز مینامند.
زمانی که سرطان از بافت اصلی به سایر قسمتهای بدن گسترش پیدا میکند، تومور جدید شبیه همان نوع سلولهای غیر طبیعی تومور اولیه بوده و به همان اسم تومور اولیه خوانده میشود. برای مثال اگر سرطان کولورکتال به کبد متاستاز دهد سلولهای سرطانی کبد همان سلولهای سرطانی کولورکتال بوده و بیماری سرطان متاستاتیک کولورکتال نامیده شده و همانند سرطان کولورکتال، درمان میشود (کاظمی اسکندانی 1388).
دانش کنونی از مکانیسمهای سرطان پیشنهاد کننده این مطلب است که علت ایجاد همهٔ سرطانها ناشی از هر دو عامل محیطی و ژنتیکی است (clapp et at 2005).
عوامل ژنتیکی، هورمونی و ویروسی روی سرطان تأثیر میگذارند باقی ماندن تغییراتی مانند آسیب بافتی، تغییرات ژنتیکی و اپیژنتیک (مثل جهش، از دست دادن هتروزیگوسیتی و متیلاسیون پروموتور) و تغییرات ترانسکریپتوم (مثل التهاب و مسیرهای آپاپتوز) در دراز مدت منجر به فعال شدن مسیرها و عملکردهای سلولی نابجا گشته و در نهایت منجر به تغییرات پیش سرطانی میگردد (Roy et el 2008).
انکوژن ها کد کننده پروتئینهای هستند که کنترل کنندهٔ تقسیم سلولی، آپاپتوز و یا هر دوی آنها هستند. آنها میتوانند به وسیله تغییرات ساختمانی، که حاصل جهش یا اتصال ژنها توسط کنار هم نشینی عناصر تحریک کننده و یا به وسیله تحریک فعال شوند. جا به جای و جهش میتواند به عنوان وقایع اولیه یا در طی پیشرفت تومور اتفاق بیفتد در حالی که تکثیر معمولاً در طی پیشرفت اتفاق می افتد هنگامی که یک
انکوژن توسط جهش فعال میشود ساختار پروتئین کد شده توسط آن در مسیر افزایش فعالیت تغییر میکند (croce2008).
جهشهای که پروتوانکوژن ها را به انکوژن ها تبدیل میکند شامل: تغییرات تک نوکلئوتیدی، تکثیر یا ازدیاد ژنی، ترکیب ژنی و سایر بازآراییهای کروموزومی است که فعالیت پروتئینهای ساخته شده توسط پروتوانکوژن ها را افزایش میدهند. جهشهای تغییر دهنده قالب، جهشهای بی معنی و جهشهایی که در جایگاه پردازش روی میدهند عموماً موجب فعال شدن انکوژن ها نمیشوند (Thomas et al 2007).
سرطان بوسیلهٔ تغییر در انکوژن ها، ژنهای سرکوب گر تومور و ژنهای microRNA ایجاد میشود
یک تغییر ژنتیکی به ندرت برای توسعه یک تومور بدخیم کافی است. بیشتر شواهد به یک فرآیند چند مرحلهای از تغییرات پی در پی در انکوژن های مختلف، ژنهای سرکوب گر تومور یا ژنهای microRNA در سلولهای سرطانی اشاره دارند (croce 2008).
انکوژن ها شکل جهش یافتهٔ یک ژن طبیعی سلولی به نام پروتوانکوژن ها است که در گسترش سرطان شرکت میکند انکوژن های که اغلب در رشد و گسترش سرطانهای انسانی شرکت دارند به وسیلهٔ ویروسها منتقل نمیشوند بلکه در نتیجه جهشهای سوماتیک در پروتوانکوژن ها ایجاد میگردند (نخعی سیستانی و همکاران 1389). پروتئینهای حاصل از پروتوانکوژن ها در شرایط عادی عملکرد حیاتی در پیام رسانی سلول، رشد و تمایز بر عهده دارند اما بیان غیر طبیعی آنها قادر به القای تومور زایی است (pappou 2010).
یک ژن سرکوب کننده تومور نوعی ژن است که بوسیلهٔ جهشهای حذف عملکرد ایجاد میشود، ژنهای سرکوب کننده تومور فرآیندهای اصلی مسئول حفظ بخشهای پایدار بافتی را کنترل میکنند این فرآیندها شامل تمامیت ژنتیکی، پیشرفت چرخه سلولی، تمایز، برهمکنشهای سلولی و مرگ میباشند. غیر فعال شدن این ژنها موجب حذف هموستازی بافتی میشود که مشخصه یک تومور در حال گسترش است (نخی سیستانی و همکاران 1389).
1-2 آناتومی روده بزرگ:
روده بزرگ از دریچه ایلئوسکال روده کوچک تا آنوس گسترش یافته است و شامل آپاندیس، کولون[3]، رکتوم [4]و کانال آنال[5] میباشد بنا به موقعیت کولون به قسمتهای مختلف تقسیم شده است: سکوم، کولون
صعودی، زاویهٔ کبدی، کولون عرضی، زاویه طحالی، کولون نوزولی و کولون سیگموئید (میبدی و همکاران 1382، ACS 2010).
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.