پایان نامه مطالعه و شناسایی سویههای باکتریایی تولیدکننده کوتیناز
فهرست محتوا
چکیده
کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه میکند. کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلیاستری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتاً توسط باندهای استری پیوند یافتهاند. اسیدهای چرب کوتین معمولاً n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقش کلیدی درحفاظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا ایفا میکند و تجزیهٔ آنزیمی آن اولین گام در فرآیند آلودگی بافت گیاهی است. هدف از این پژوهش استخراج کوتین و مقایسهٔ آنها در میوههای مختلف و غربالگری باکتریها و قارچهای تولید کننده آنزیم کوتیناز و شناسایی گونه آنها با تعیین توالی ناحیه 16S DNA میباشد. با توجه به اهمیت آنزیم کوتیناز به ویژه در صنعت، این مطالعه گامی مهم در شناسایی سویههای بومی تولید کننده آنزیم کوتیناز و استفاده از آنها در صنعت به شمار میآید. بدین منظور پوست میوههای مختلف را جمعآوری و در بافر اگزالات جوشانده و بعد از شستوشو در آون خشک شده و آسیاب گردید. از پودر حاصل به روش کلرفرم متانول کوتین آن جداسازی شد. نتایج نشان میداد که درصد کوتین استخراج شده در سیب بیشتر است و احتمالاً سیب نسبت به آفات و بیماریها مقاومتر است. در مرحلهٔ بعد جداسازی سویهای تولیدکننده آنزیم از نمونههای مختلف انجام شد. نمونهها به داخل پلیت های حاوی محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن است تلقیح داده و سویههای غربالگری شده و به کمک سوبسترای اختصاصی پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی سنجیده شد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 6 سویه جداسازی شده با استفاده از نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار گرفتند. به این منظورDNA ژنومی از سویههای تولیدکننده آنزم کوتیناز به روش جوشاندن، CTAB و کیت استخراج شد و واکنش PCR با استفاده از 9 آغازگر RAPD انجام گردید. برای شناسایی و توالی یابی سویهها با استفاده از rDNA 16S عمل PCR با دو پرایمر 8F و 1541Rانجام شد سپس محصولات PCR برای توالی یابی ارسال شد. این مطالعات نشان میدهد که سویههای جداسازی شده دارای فعالیت کوتینازی مناسبی بوده و میزان بالایی از آنزیم کوتیناز را تولید میکنند که قابلیت مصارف تجاری صنعتی دارند.
کلمات کلیدی: کوتین، آنزیم کوتیناز، سنجش فعالیت آنزیمی، تنوع ژنتیکی، نشانگر RAPD
فهرست مطالب
- فصل اول معرفی.. 1
- 1- 1- مقدمه. 2
- 1- 2- اهمیت و ضرورت تحقیق.. 2
- 1- 3- فرضیات واهداف تحقیق.. 4
- فصل دوم مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین.. 6
- 2- 1- کوتین.. 7
- 2- 1- 1- جداسازی کوتین.. 12
- 2- 1- 2- دپلیمریزاسیون کوتین.. 12
- 2- 1- 3- مونومرهای تشکیل دهنده کوتین.. 13
- 2- 3- آنزیم کوتیناز 16
- 2- 3- 1- کلون و بیان کوتیناز 18
- 2- 3- 2- ساختار کوتیناز 19
- 2- 3- 3- عملکرد کوتیناز 26
- 2- 3- 4- کاربردهای کوتیناز 27
- 2- 3- 5- استفاده از کوتیناز به عنوان یک بیوکاتالیست در محیطهای غیرمعمول. 29
- 2- 3- 6- عملکرد کوتیناز در واکنشهای هیدرولیزی و سنتزی.. 33
- 2- 3- 7- ترانس استریفیکاسیون. 35
- 2- 3- 8- پایداری کوتیناز 36
- 2- 3- 9- فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز 38
- 2- 3- 10- مکانیسم عمل کوتیناز 39
- 2- 3- 11- مقایسهی آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی.. 41
- 2- 4- نشانگرهای ژنتیکی.. 42
- 2- 5- نشانگرهای مورفولوژیکی.. 42
- 2- 6- نشانگرهای مولکولی.. 43
- 2- 7- نشانگرهای پروتئینی یا بیوشیمیایی.. 44
- 2- 8- نشانگرهای DNA.. 45
- 2- 8- 1- نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR.. 46
- 2- 8- 2- نشانگرهای مبتنی بر PCR.. 46
- 2- 9- نشانگرهای غیر اختصاصی.. 47
- 2- 9- 1- RAPD.. 47
- 2- 10- نشانگرهای اختصاصی.. 48
- 2- 10- 1- AFLP. 48
- 2- 10- 2- SSR.. 48
- 2- 10- 3- RFLP-PCR.. 50
- 2- 10- 4- RFLP Based PCR با اتصال ناقص… 51
- فصل سوم مواد، تجهیزات و روش تحقیق.. 52
- 3- 1- استخراج کوتین.. 55
- 3- 2- نمونه برداری.. 55
- 3- 3- غربالگری و جداسازی گونههای تولیدکننده آنزیم کوتیناز 55
- 3- 4- تهیه slant از سویههای جدا شده 57
- 3- 5- نگهداری طولانی مدت سویهها 57
- 3- 6- تهیه گلیسرول. 58
- 3- 7- تهیه محیط کشتLB.. 58
- 3- 8- Assay آنزیمی.. 58
- 3- 9- Assay ویژه آنزیمی.. 60
- 3- 10- استخراج DNA.. 60
- 3- 10- 1- استخراج DNA به روش جوشاندن. 60
- 3- 10- 2- استخراج DNA به رو ش CTAB.. 61
- 3- 10- 3- روش استخراج DNA با کیت.. 64
- 3- 11- اندازهگیری کیفیت و غلظت DNA.. 65
- 3- 12- رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید. 69
- 3- 13- واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction. 70
- 3- 14- راه اندازی واکنش PCR.. 74
- 3- 15- برنامهPCRبرای نشانگرRAPD.. 76
- 3- 16- توالییابی سویههای تولیدکننده آنزیم کوتیناز با استفاده از 16S rDNA.. 77
- 3- 17- الکتروفورز محصولات واکنش PCR.. 78
- فصل چهارم. 80
- 4- 1- بررسی میزان کوتین در میوههای مختلف.. 81
- 4- 2- جداسازی سویهها 87
- 4- 3- بررسی فعالیت آنزیم کوتیناز در نمونهها 87
- 4- 4- نتایج بررسی کیفیت DNA بعد از استخراج. 88
- 4- 5- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی 6 سویه بر اساس نشانگر مولکولی RAPD.. 89
- 4- 6- نتایج حاصل از تجزیه خوشهای بر اساس نشانگر RAPD.. 89
- 4- 7- تجزیه به مختصات اصلی.. 90
- 4- 8- نتایج تجزیه باندهای حاصل از 8 پرایمر RAPD.. 92
- 4- 9- ضریب همبستگی کوفنتیک… 93
- 4- 10- شناسایی و توالی یابی سویهها با استفاده از 16S rDNA.. 93
- فصل پنجم. 95
- 5- 1- استخراج کوتین.. 96
- 5- 2- سنجش فعالیت آنزیمی کوتیناز 97
- 5- 3- استخراج DNA.. 98
- 5- 4- تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر RAPD.. 98
- پیشنهادات.. 100
- 6- 1- پیشنهادات.. 101
فصل اول
معرفی
1- 1- مقدمه
استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسمها مستلزم ترشح آنزیمهای هیدرولازی است که مهمترین آنها کوتیناز میباشد. کوتیناز توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلیاسترهای کوچک را داراست. کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه میکند. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارد و دارای ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب است [1]. کوتین یک پلی استر بسیار هیدروفوب غیر محلول در آب و از مشتقات گاما هیدروکسی اسیدچرب میباشد که در ساختار کوتیکول گیاهان وجود دارد [2]. اصطلاح کوتین از کوتوس[1] گرفته شده و این اصطلاح در اصل برای توصیف مادهای است که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده و در برابر اسیدهای قوی مقاوم است. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارند. مطالعات بر روی کوتین و کوتیکول گیاه از قرن نوزده آغاز شده است. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی میکنند مانند چمندریا[2]، زئوسترا مارینا[3] دارای کوتین هستند و مونومرهایی از همان نوع مونومرهایی که در بقیهٔ گیاهان یافت میشود دارند.کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلیاستری هیدروکسی و اپوکسیاسیدچرب تشکیل شده که عمدتاً توسط باندهای استری پیوند یافتهاند[3]. اسیدهای چرب کوتین معمولاً n-c16 و n-c18 بوده و دارای یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقشی کلیدی در حفاظت از گیاه در برابر عوامل بیماریزا ایفا میکند [4] و تجزیهٔ آنزیمی آن یکی از اولین گامها در فرآیند آلودگی است. در واقع کوتیکول یک لایهٔ محافظ چربیدوست است که برگها، ساقهها و میوهها را میپوشاند. بر روی کوتیکول لایهای از موم پوشیده شده است که علاوه بر اینکه مانع از تبخیر آب گیاه میشود در برابر عوامل بیماریزا و آفات نیز از گیاه حفاظت میکند. استفاده از آنزیم کوتیناز باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی شده و همچنین کوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربی زدایی به کار رفته است. تجزیهٔ پلاستیکها از قبیل پلیاسترهای مصنوعی، محصولات محلول در آب با استفاده از کوتیناز بدست آمده است.
1- 2- اهمیت و ضرورت تحقیق
با توجه به ویژگیها خاص آنزیم کوتیناز و کاربردهای ان در صنعت و بیوتکنولوژی و نیز چشم انداز روشن در فرایند تجزیه پلاستیک و الاینده های پلی استری موجود در طبیعت، یافتن انزیمی با شرایط مطلوبتر همواره مورد توجه بوده است. آنزیمهای کوتیناز در باکتریها و قارچها مطالعه شدهاند اما آنزیمهای کوتیناز گونههای باکتریایی تا کنون به میزان کمتری مورد بررسی قرار گرفتهاند.
امروزه یافتن آنزیمهایی با خصوصیات جدید و ویژگیهای مطلوبتر که از نظر صنعتی و پزشکی اهمیت دارند یکی از زمینههای مهم پژوهشی در علوم بیوتکنولوژی میباشد. یکی از این آنزیمهای مهم آنزیم کوتیناز میباشد که یک آنزیم هیدرولازی و ترشحی بوده و کوتین را تجزیه میکند. آنزیم کوتیناز متعلق به خانواده سرین هیدرولازها بوده و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگیهای زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. آنزیم کوتیناز اسیدهای چرب کوتین را با هیدرولیز باندهای استری آزاد میکنند. استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسمها مستلزم ترشح آنزیمهای هیدرولازی است. اگرچه هنوز مشخص نیست که چگونه یک پلیمر میتواند وارد سلول شده و باعث تولید آنزیمهای هیدرولازی شود، اما یک احتمال در این زمینه این است که میکروارگانیسمها یک سطح پایهای از چندین آنزیم هیدرولازی ترشح میکنند و سپس با عملکرد این آنزیمها بر روی مواد پلیمری، این مواد هیدرولیز شده و محصولات هیدرولیز شده وارد سلول شده و سنتز آنزیمها را القا میکنند .
کوتیناز یک آنزیم چند منظوره است و چندین مشخصه جالب دارد که میتواند در فرایندهای صنعتی استفاده شود. از مهمترین شاخصههای این آنزیم توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی استرهای کوچک میباشد.
کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسید چرب تشکیل شده که عمدتاً توسط باندهای استری پیوند یافتهاند. اسیدهای چرب کوتین معمولاً n-c16 و n-c18 بوده و شامل یک تا سه گروه هیدروکسیل میباشند. کوتینازها میتوانند به عنوان یک رابط بین استرها و لیپیدها در نظر گرفت، این آنزیم استرهای محلول را هیدرولیز میکند و تریگلیسریدها را امولوسیون میکند بنابراین کوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربیزدایی به کار رفته است. از این آنزیم به عنوان یک biocatalyst و یک bioprocesses صنعتی در بیوتکنولوژی استفاده شده است. یکی دیگر از کاربردهای جالب کوتیناز تجزیه پلاستیکها است. به عنوان نمونه، تجزیه پلی کاپرولاکتون که یک پلی استر سنتزی میباشد به محصولات محلول در آب با استفاده از آنزیم کوتیناز انجام گرفته است. دیگر کاربردهای کوتیناز عبارتند از شرکت در واکنشهای سنتزی و هیدرولیتیک میباشد که از جمله آنها میتوان به هیدرولیز چربی شیر در صنایع لبنی، استفاده در صنایع oleochemistry و سنتز تریگلیسریدهای ساختاری اشاره نمود. یکی از خصوصیات ویژه آنزیم کوتیناز، فعالیت آن با گسترهای از سوبستراهای مختلف میباشد که باعث شده این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد استفاده قرار گیرد. این آنزیم همچنین باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی شده است. با توجه به طیف وسیع عملکردی آنزیم در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم میتواند در رفع آلودگیهای زیست محیطی نقش مهمی ایفا کند و این ویژگی باعث شده است که این آنزیم در صنعت و بیوتکنولوژی مورد توجه قرار گیرد.
یکی از مشکلات زیست محیطی در جوامع امروزی تجزیهٔ زبالهها در محیط زیست است. کوتیناز به عنوان یک آنزیم سبز میتواند توانایی از بین بردن زبالههای پلیاستری را دارا باشد و میتوان از آن در سنتز پلیاسترهای قابل تجزیه در طبیعت استفاده کرد.
کوتیناز ها و لیپازها متعلق به گروه استراز ها هستند که قادر به تسریع هیدرولیز باندهای استری هستند. نسبت اجزای سازنده آمینواسیدی کوتیناز باکتریایی به طور کاملاً مشخص از کوتیناز قارچی و گیاهی متفاوت است. کوتیناز یک کاتالیست موثر در محیطهای آبی یا ارگانیک است. این مجموعه ویژگیها باعث شده است که این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد توجه قرار گیرد. لذا شناسایی سویههای مختلف بومی تولید کننده این آنزیم از اهمیت خاصی برخوردار است.
[1] cutose
[2] sea grass
[3] Zoestra marina
مریم بازگشا –
خوب و کاربردی است