پایان نامه تصفيه ديافيلتريشن
آزمون هاي كنترل كيفي سرمهاي درماني:
در موسسه واكسن و سرم سازي رازي آزمون هاي مختلفي جهت تعيين سلامت و ايمني سرمهاي درماني تصفيه شده و ارزيابي دقيق عيار سرمها انجام مي دهند كه اين آزمون ها به طور كلي به دو گروه فيزيكوشيميايي و بيولوژيكي تقسيم مي شوند.
آزمون هاي گروه اول شامل: اندازه گيري PH، وزن خشك، نيتروژن پروتئين (به دو روش كجلدال و بيوره) و غيره مي باشد.
آزمون هاي گروه دوم شامل: آزمون پيروژني، سلامت و ايمني، پوتنسي و غيره مي باشد.
در اين بخش ما به دليل مقايسه نمونه به دست آمده و تصفيه شده توسط دستگاه دياليز با نمونه اي كه موسسه به روش سنتي دياليز مي كند آزمون هاي فوق را در شرايطي يكسان براي هر دو نمونه انجام داديم و نتايج را با هم مقايسه كرديم كه پاره اي از اين آزمون ها و نحوه اجراي آنها را شرح داده ايم.
به دليل اينكه آزمون هاي گروه اول (فيزيكو شيميايي) در حوصله اين پايان نامه و موضوع ارائه شده است لذا به ذكر اين آزمون ها و نحوه اجراي آنها بسنده شده است و آزمون هاي گروه دوم كه بيشتر جنبه پزشكي دارند را فقط به ذكر يكي از آنها كه پوتنسي مي باشد اكتفا كردهايم.
غلظت يون هيدروژن PH:
غلظت يون هيدروژن با پارامتر PH بيان مي گردد و در همه موارد به كمك PH متر الكترونيكي[1] اندازه گيري مي شود. لازم به ذكر است كه حدود قابل قبول PH براي سرمهاي درماني 2/7-4/6 مي باشد.
وزن خشك: Total Solid
اساس آزمايش بر پايه قرار دادن 1 ميليليتر سرم در شرايط خلاء درون آون در دماي 37 براي مدت 24 ساعت و سپس توزين آن مي باشد.
نتيروژن پروتئين: (به روش كجلدال) Protein Nitrogen Content
نيتروژن در مواد گوناگون تحقيقاتي، صنعتي، كشاورزي يافت مي شود. مثلا اين عنصر را مي توان در آمينواسيدها، پروتئين ها، داروهاي سنتزي، كودها، مواد منفجره، خاكها، آبهاي آشاميدني و رنگها يافت. بنابراين روش هاي تجزيه اي براي تعيين نيتروژن خصوصاً در مواد آلي از اهميت زيادي برخوردارند.
معمولترين روش براي تعيين نيتروژن مواد آلي، روش كجلدال است. اين روش بر پايه تتراسيونهاي خنثي شدن استوار است. اين روش، روشي ساده بوده و به تجهيزات خاصي نياز ندارد و نيز مي توان آن را به سهولت براي تجزيه معمولي تعداد زيادي نمونه به كار برد.
روش كجلدال، روش استانداردي براي تعيين مقدار نيتروژن در پروتئين، غلات، گوشت و ساير مواد زيستي است، چون پروتئين ها تقريباً حاوي درصد يكساني از نيتروژن هستند، لذا با ضرب اين درصد در يك عامل مناسب (25/6 براي گوشتها، 38/6 براي لبنيات، 7/5 براي حبوبات) مي توان درصد پروتئين نمونه را به دست آورد.
اين آزمايش روي نمونه هاي پلاسما و فرآورده نهايي به روش كجلدال انجام شده و مقدار نيتروژن نمونه به دست مي آيد.
اين آزمايش روي نمونه هاي پلاسما و فرآورده نهايي به روش كجلدال انجام شده و ميزان نيتروژن نمونه به دست مي آيد.
از آنجا كه هر يك ميلي گرم نيتروژن از 25/6 ميليگرم پروتئين از 25/6 ميلي گرم پروتئين فراهم مي شود. پس از اندازه گيري نيتروژن پروتئين مي توان مقدار پروتئين را معلوم نمود.
در اين روش 1 نمونه سرم ضد مار يا عقرب را برداشته و آن را با 17 سرم فيزيولوژي (كلرور سديم) 2 تري كلرواستيك 100% مخلوط كرده و درون يك لوله آزمايش ريخته و براي مدت 15 دقيقه با آژيناتور با فاصله به هم مي زنيم. بعد آن را درون دستگاه سانتريفيوژ قرار مي دهيم با دور 2000 دور در دقيقه براي مدت 15 دقيقه، تا رسوب آن كاملا ته نشين شود بعد رسوب را با چند قطره سود 40% يا 10 نرمال حل كرده و در يك بالن ژوژه 25 ريخته و با آب مقطر آن را به حجم مي رسانيم.
بعد 2 از اين محلول را در فيول ريخته و به آن 6 از محلول منيراليزاتور مي افزاييم. سپس فيولها را درون زنبيل گذاشته و روي هيتر قرار مي دهيم. براي مدت 2 تا 3 روز در روي هيتر مي ماند. اول به رنگ تيره در مي آيد و بعد هنگامي كه به رنگ سبز تبديل شد آن را بر مي داريم (به صورت سبز غليظ) بعد اين محلول غليظ سبز رنگ را برداشته و درون يك ارلن مي ريزيم و به آن 8 محلول NaOH، 40% اضافه مي نماييم كه در اين حالت ازت به آمونياك تبديل مي شود.
درون يك بشر 100، ما 10 اسيد بوريك 2% مي ريزيم و 3-2 قطره انديكاتور به آن مي افزاييم و مي گذاريم تا بماند و سپس اين محلول را قطره قطره به درون ارلن اضافه كرده تا به حجم 80 برسد و بعد توسط اسيد سولفوريك تيتر كرده تا به رنگ صورتي تبديل شود. و از روي ميزان مصرف اسيد طبق فرمول زير مي توان ميزان ازت را به دست آورد كه اگر در 25/6 ضرب شود ميزان پروتئين به دست مي آيد.
T: ميزان شاهداست (هرسانتي متر مكعب ، با حدود 0.2 gr ازت تركيب مي شود و سولفات آمونيوم مي دهد)
x: ميزان اسيد مصرفي در زمان تيتراسيون
Total protein= N.P * 6.25
به عنوان مثال اگر ما محلولي را با 4 مصرف اسيد سولفوريك تيتر نماييم ميزان كل پروتئين به صورت زير محاسبه مي شود.
Total protein= 9.5 * 6.25 = 59.375
طرز تهيه محلول منيراليزاتور:
105gr سولفات پتاسيم به اضافه 6gr سولفات مس را با هم مخلوط كرده و 150 اسيد سولفوريك غليظ را به آهستگي به آن افزوده و سپس آنها با آب مقطر به حجم 900 مي رسانيم.
طرز تهيه انديكاتور:
83mgr برموكروزول را با 17mgr متيل قرمز مخلوط كرده و با الكل 96% به حجم 100 مي رسانيم.
روش كجلدال به حضور سولفات آمونيوم حساس است. لذا نمونه ها بايد فاقد سولفات آمونيوم باشد كه اين كيفيت با آزمايش كلرور باريم قابل بررسي است.
آزمون كلرور باريم جهت بررسي سولفات آمونيوم:
هدف اين آزمايش تأييد عدم حضور مقادير قابل توجه سولفات آمونيوم پس از دياليز است. به عبارت ديگر كامل بودن دياليز با منفي بودن نتيجه اين آزمايش معلوم مي شود.
انجام اين آزمايش از آنجا كه غلظت پروتئين يا نيتروژن پروتئين فرآورده نهايي تصفيه به روش بيوره يا كجلدال انجام مي گيرد و هر دو روش به حضور يون آمونيوم حساس هستند حائز اهميت است. نتيجه آزمايش مذكور اگر منفي باشد نشانه حضور مقادير بسيار ناچيز يون آمونيوم (حدود چند ميكروگرم در ليتر) در نمونه است.
روش كار بدين صورت است كه 1ml از نمونه محلول حاصل دياليز را در لوله آزمايش ريخته و به آن 8ml سرم فيزيولوژي و 1 ml كلرو باريم 10% اضافه مي شود.
اگر محلول حاصل كدر شود نشانه ايجاد رسوب BaSO4 است و در غير اين صورت اگر محلول شفاف بود مي توان نتيجه مي گرفت كه غلظت يون سولفات در نمونه بسيار ناچيز و كمتر از g/Lit4 است. (اين مقدار با توجه به ثابت حاصلضرب حلاليت سولفات باريم محاسبه گرديده است كه چيزي در حدود ( است)
در اين شرايط غلظت يون آمونيوم نمي تواند خطاي قابل ملاحظه اي در سنجش غلظت پروتئين با روش هاي بيوره يا كجلدال ايجاد نمايد.
تعيين غلظت پروتئين به روش بيوره: Biuret Method
اساس اين روش مبتني بر اين واقعيت است كه در يك محيط قليايي املاح مس دو ظرفيتي (Cu2+) مي توانند با بيوره كمپلكس رنگي ايجاد كنند. چنين واكنشي با كليه مواد پروتئيني كه حداقل داراي دو پيوند پپتيدي هستند نيز قابل اجرا است.
اين محلول عبارت است از محلول سولفات مس در يك قلياي قوي، كه رنگ آبي- ارغواني اين محلول به اطلاعاتي در مورد عدد كئورديناسيون كمپلكس بستگي دارد. بين Cu2+ و چهار اتم نيتروژن دو پپتيد يك همسايگي و مجاورت بوجود مي آيد. دي پپتيدها و اسيدهاي آمينه آزاد نمي توانند اين واكنش را صورت دهند.
اين صفحه براي رسم واكنش ها است.
كمپلكس حاصل بيشترين جذب را در طول موج nm560-540 دارد.
غلظت كمپلكس حاصل با افزايش غلظت پروتئين بيشتر شده و متناسب با آن شدت جذب در اين طول موج افزايش مي يابد.
بدين ترتيب به كمك اسپكتروفتومتري[2] جذبي در طول موج nm560-540 غلظت پروتئين محلول در نمونه تخمين زده مي شود.
واكنشگر بيوره محلولي است محتوي gr5/1 سولفات مس (CuSO4-5H2O) و gr6 سديم پتاسيم تار تارت در ml500 آب كه محلول () 10% هيدروكسيدسديم به آن اضافه شده و حجم آن با آب به 1 lit افزايش مي يابد. براي ذخيره سازي طولاني مدت و حفظ قدرت واكنشگر، 1gr يديد پتاسيم به آن افزوده شده و در ظرف پلاستيكي و در محل تاريك و سرد (8) نگهداري مي شود.
نحوه آزمايش به اين صورت است كه:
ما يك نمونه Blank مي سازيم كه محتوي ml5/0 سرم فيزيولوژي و ml5/2 محلول بيوره است و با اين نمونه نخست دستگاه را تنظيم كرده (صفر مي نماييم) البته قبل از اين كار نمونه را براي مدت 15 دقيقه در دماي 37 قرار مي دهيم. سپس در 8 لوله آزمايش نمونه هاي زير را مي سازيم.
8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | Additions (ml) | |
1.2 | 1.0 | 0.8 | 0-6 | 0.4 | 0.2 | 0.1 |
–
|
Standard BSA (2mg/ml) | |
0.3 | 0.5 | 0.7 | 0.9 | 1.1 | 1.3 | 1.4 |
1.5
|
H2O (deionized) | |
1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
1.5
|
Biuret reagent |
و براي مدت 15 دقيقه در دماي 37 درون آن قرار مي دهيم.
بعد با نمونه اول كه آن هم يك نمونه Blank است دستگاه UV را كه در nm 540 جذب، تنظيم شده صفر مي نماييم.
سپس لوله هاي 2 تا 8 را يكي پس از ديگري درون دستگاه قرار مي دهيم و جذبشان را مي خوانيم و در دستگاه ثبت مي نماييم و نمودار گراف آن را رسم مي نماييم كه اگر به صورت يك خط راست بود، نمونه هاي ما قابل قبول هستند و بعد نمونه سرم اصلي را درون دستگاه قرار داده و آن نمونه را آنقدر رقيق كرده كه جذبش در روي خط راست قرار مي گيرد. (در محدوده جذب باشد) بعد عدد جذب نشان داده شده را در مقداري كه رقيق كرده ايم ضرب كرده و ميزان پروتئين حاصل به دست مي آيد.
روش ديگري هم وجود دارد كه به صورت زير مي باشد. سه لوله آزمايش مطابق زير آماده مي شود.
لوله شماره 1 (Test): محتوي ml5/0 نمونه مورد آزمايش به علاوه ml5/2 واكنشگر بيوره
لوله شماره 2 (Standard): محتوي ml5/0 از محلول پروتئين استاندارد (mg/ml6) به علاوه ml5/2 واكنشگر بيوره.
لوله شماره 3 (Blank): محتوي ml5/0 سرم فيزيولوژي بعلاوه ml5/2 واكشنگر بيوره
تمامي لوله ها را در دماي 37 براي مدت 30 دقيقه قرار مي دهيم. ابتدا دستگاه اسپكتروفتومتر را با بلانك صفر كرده و سپس ميزان جذب لوله هاي 1 و 2 در طول موج nm560-540 اندازه گيري مي شود.
براي محاسبه غلظت پروتئين از رابطه:
6* |
مقدار جذب لوله شماره 1 |
= غلظت پروتئين نمونه مورد آزمايش (mg/ml) |
مقدار جذب لوله شماره 2 |
به دست مي آيد.
غلظت پروتئين نمونه مورد آزمايش به روش بيوره (حساسيت روش بيوره mg/ml 6-1) هنگامي به مقدار واقعي نزديك است كه بين mg/ml 6-1 باشد، در غير اين صورت مي توان با غليظ يا رقيق كردن، غلظت آن را در حدود دامنه مذكور قرار داد.
آزمون پوتنسي: Potency
اين آزمايش به منظور تعيين قدرت سرمهاي درماني ضد سم در خنثي سازي سم صورت مي گيرد. هنگامي كه مقدار معيني سم استاندارد، با رقتهاي مختلف سرم ضد سم مخلوط شود و به حيوان تزريق گردد. واكنش بدن حيوانات در برابر سم با بعضي رقتهاي ضد سم سركوب مي شود. بدين ترتيب حداقل مقدار سرم ضد سم براي خنثي كردن اثر سم تعيين مي شود.
اساس اين آزمايش بدين صورت است كه تعدادي موش را انتخاب كرده و آنها را براي تزريق سم آماده مي نماييم. دزهاي مختلفي از سم را درست كرده و سپس آن را به بدن حيوان همراه با پادزهر تزريق كرده كه تزريق از ناحيه دم موش صورت مي گيرد. سپس موشها را براي مدت 24 ساعت به حال خود مي گذاريم و پس از اين مدت به سراغ موش ها رفته و تعداد تلفات را مشاهده كرده و حداقل دزي را كه سرم توانسته سم را خنثي نمايد مشخص مي نماييم.
بدين ترتيب كه در دزهاي ….0.3 , 0.2 , 0.1 عمل تزريق صورت مي گيرد كه نحوه تهيه سم به صورت زير است.
براي سم 0.1 ما به ميزان 0.1 ml سم مار را به حجم 1 مي رسانيم و بعد 1 سرم فيزيولوژي به آن مي افزاييم و سپس عمل تزريق را انجام مي دهيم كه به هر موش 0.5 از ناحيه رگ دم موش تزريق مي شود. هر دز را به سه عدد موش تزريق مي كنيم كه در صورتي كه حداقل 2 موش سالم باشند سرم ضد مار توانسته آن دز را خنثي نمايد و قابل قبول است.
براي اينكه در قفس دزها با هم قاطي نشوند و بتوان فهميد كه كدام موش چه دزي بهش تزريق شده است. موش ها را رنگ كرده تا با هم قاطي نشوند، هر دز يك رنگ مي شود.
اين آزمون مويد تاثير درماني سرم ضد سم در غلظت هاي درماني است.
[1] – PH متر الكترونيكي Radiometer مدل 29- دانمارك
[2] – اسپكتوفتومتر Jonior مدل Instrument, 16A coleman- آمريكا specto photometry – 1
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.