پایان نامه مروري برروشهاي ويروسشناسي (تخم مرغ جنيندار، كشت سلول، Elisia، HI، PCR)
فهرست محتوا
مقدمه:
كشت و مطالعه سلولهاي حيواني اعم از كشت اوليه (Primary culture)، كشت ثانويه Secondary culture يا (Sub culture) يكي ازروشهاي بسيار با ارزش آزمايشگاهي است كه ازنظر اطمينان و اقتصادي بودن آن جهت مطالعه ويروسها بكار گرفته شده و همچنين دربحث توليد فرآورده هاي بيولوژيكي ويروسي نيز دراقصي نقاط گيتي مورد توجه مي باشد. روش فوق همانند ساير رشته هاي علوم تاريخچه هاي آموزنده دارد كه به اختصار جهت آگاهي تقديم ميگردد.
دراواخر قرن گذشته سال 1885 ويليهام رو Wilihelm Rouxتوانست لايه اي از يك بافت عصبي جنين جوجه تكامل يافته را دريك محلول نمكي گرم زنده نگاه دارد و اعتقاد داشت قدرت زيستي درخود سلول نهفته است. يكي از قدمهاي اساسي درسال 1886 بوسيله ركلين هوزن برداشته شد و آن نگاهداري سلولهاي خوني دوزيستان درظرف استريل تحت شرايط خاص بمدت 35 روز بود ولي اوائل قرن بيستم درسال 1907 هاريسون و متعاقباً آلكسيس كارل درسال 1912 روشي را پاي گذاري نمودند كه سلولهاي حيواني بطريقه اصولي يا سيستماتيك مورد مطالعه قرارگرفت.
اگر چه بيشتر مطالعات برروي تكه هائي از نسوج زنده آغاز گرديد اما عملاً 40 تا 50 سال بهره برداري ازسلولهاي جداي از هم Disperse بصورت امروزي ديده نمي شود تا اينكه درسال 1950 Cell culture به جاي Tissue cultur وارد مرحله جديدي گرديد كه درواقع نياز بشر جهت مطالعه ويروسهاي بيماريزا و لزوماً تهيه واكسنهاي موثر عليه آنها اساس و پايه اين رشته از علوم زيستي شد.
درواقع عنوان Tissue cultur نام در برگيرنده براي Cell culture هر دو ميشود نكته اساسي كه نبايد فراموش شود اين است كه سلولها از نسج زنده جدا شده خودبخود و مستقيماً به تزايدProliferetion ادامه دهند.
اينكار بوسيله عوامل آنزيماتيك، مكانيكي يا شيميائي ازكشت اوليه انجام مي شود.
هاريسون ازقورباغه به عنوان منبع اصلي جهت تجارت خود استفاده كرد و بطوريكه مي دانيم اين حيوان جزء حيوانات خون سرد محسوب مي شود. هاريسون تصور ميكرد كشت سولهاي قورباغه همانند نسوج پستانداران است كار تحقيقي جالب نامبرده موفقيت درروش Invitro مي باشد. بعد ازتجارب هاريسون ازانواع ديگر حيوانات خون سرد جهت كشت استفاده شده ولي توجه علوم پزشكي جهت كشت سلولهاي حيوانات خونگرم و بخصوص بررسي پاتولوژيكي ارزش بيشتري به اين رشته از علم داد.
متعاقباً نسوج مختلف بخوبي رشد نمودند و بخصوص جنين تخم مرغ بعنوان راه مناسب انتخاب گرديد ولي موفقيت و پيشرفت چشم گير پرورش جوندگان و بخصوص تهيه جوندگان خالص ازنقطه نظر ژنتيكي موجب گرديد تا كشت سلولهاي پستانداران در درجه اول اهميت قرارگيرد.
ارل Earls و همكاران درسال 1943 ثابت كردند كه مي توان از سلولهاي جوندگان سلولهاي كشت متوالي يا Contineous culture تهيه نمود درحاليكه تا آن زمان ازسلولهاي جنين جوجه بيشتر در كشت هاي اوليه استفاده مي گرديد. مطالعات تومورزائي سلولهاي جوندگان از اين مرحله به بعد ميسر شد كه خود راه را براي كارهاي تحقيقاتي هموار نموده است بطوريكه موش درسال 1992 بعنوان بهترين حيوان مورد مطالعه ژنتيكي يا Transgenetic انتخاب گرديد كه براي كارهاي بيوتكنولوژي از آن استفاده مي شود.
درسال 1961 دو نفر از دانشمندان بنام (Hayflick,) هيفليك و مورد هداز سلولهاي سرطاني Hela كه درسال 1952 بصورت كشت متوالي معرفي شده بود، تجارب ارزنده تري ارائه دادند و بحث كشت معلق يا Suspension culture رامطرح نمودند. كشت سلولهاي مهره داران پست و حشرات تا چندين دهه مورد توجه قرارنگرفت اما درسالهاي اخير بخاطر نياز بشريت به مواد غذائي بيشتر، بحث كشاورزي و پيشگيري از آفات ويروسي باعث رشد و شكوفائي اين تحقيقات شده بطوريكه با استفاده از اين نوع سلولها بعنوان vector بخوبي استفاده شده است.
درپايان كلام بخاطر نقش منابع دريائي و بخصوص ماهيها و بيماريهاي ويروسي ماهي نياز بداشتن سلولهاي ماهي بسيار فراگير شده بطوريكه تيره هاي مختلفي از اين نوع درشرق دور به خصوص ژاپن و چين تهيه و مورداستفاده محققان مي باشد. اگر چه سلولهاي مهره داران پست مورد توجه قرارگرفته است ولي اهميت سلولهاي نسوج پستانداران همچنان پابرجا و جاوداني است. اصولي كه دركشت سلول مورد توجه قرار مي گيرند، عبارتنداز:
شروع كار كردن، آماده نمودن وسائل و لوازم كشت، جدانمودن سلولها ازنسج مورد آزمايش، تخمين يا برآورد سلول بدست آمده، هنگاميكه درآزمايشگاهي سلول سالم، يكنواخت و بدون آلودگي دردسترس بود اتفاقات زير را مي توان انتظار داشت: فعاليتهاي داخل سلولي، تكثير و القاء اسيد نوكلئيك(Transcription) سنتزپروتئين، متابوليسم انرژي، مطالعات داروئي و هورموني، جابجائي RNA، واكنشهاي متقابل مانند مواد غذايي، عفونت، سرطان زائي، واكنشهاي متقابل سلول به سلول، محصولات سلولي بالاخره تجارب ژنتيكي همانند Manipulation ,Transformation,Immortalization را بايد يادآور شد.
استفاده بسيار جالب و جديد ازكشت سول عبارت است از علوم پزشكي تهيه واكسنهاي ضد بيماريهاي ويروسي انسان و همچنين تحقيقات سرطان شناسي نئوپلازي، توليد سلولهاي زنجيره اي Cell Iine كاربرد آنها جهت تهيه ويروسها موجب پيشرفت كشت سلول بصورت مدرن شده است بخصوص آندسته سلولهائيكه براي آناليز مواد شيميائي مورد نياز مي باشند. اينكارها موجب فعاليت شركتهاي خصوصي سازنده محيط هاي غذائي مناسب كشت سلولي همچنين سرمهاي مناسب اعم از F.B.S or Calf serum سرم تهيه شده ازجنين گوساله گرديده است. ناگفته نماند كه استفاده از آنتي بيوتيك ها، كاركردن درزير چادرهاي هواي استريل كمك شايان توجهي به عرضه كشت سلول مي باشد. استفاده از كشت سلول زمينه تحقيق را براي پژوهشگران بازمي گذارد تا تجربيات پيچيده علمي را بتوانند خارج از محيط بدن انسان يا حيوان بصورت Invitro عملي نمايند و نتايج صحيح را بگيرند. علاوه بر كاربرهاي ويروس شناسي و سرطان شناسي روشهاي ديگري نيز مورد عمل قرارگرفته كه عبارتند از ادغام دو سلول دريكديگر Cell Fussion كه اگر چه از سال 1961 آغاز شده بود ولي تا سال 1993 تحقيقات مربوطه ادامه داشته است بعلاوه تهيه سرمهاي Specific منوكلونال كه بجاي Polyclonal بكار رفته تا نتايج صحيح تري بدهد.
درچند سال اخير تحقيق درتهيه انسولين ازكشت سول كه يكي از تجربيات بسيار با ارزش بيوتكنولوژي قلمداد شده و مي تواند كمك شايان توجهي به بيماران مبتلا به قند يا ديابت بنمايد. كاربرد و استفاده از سلولهاي پرورش يافته درآزمايشگاه كه جايگزين نسوج سوخته وغيرقابل استفاده بيماران پوستي واقع مي شود روزنه اميد بخشي به روي اينگونه متقاضيان بازكرده است. ترميم ماهيچه هاي تحليل رفته درموشها كه پيوند آن موفقيت آميز شده ازكارهاي تحقيقي بسيار با ارزش گزارش شده است حتي براي معالجه بيماري پاركينسون نيز از كشت سلول استفاده شده است. موارد سودمند و موارد زيان آور كشت سلول را درپايان مقدمه متذكر ميگردد.
2-3- موارد سودمند كشت سلول:
1-كنترل محيط زيست، براي كنترل عوامل فيزيكو شيميائي حاكم بر محيط مانند PH، حرارت فشار اسمزي، اكسيژن O2 و يا ايندريد كربنيك CO2 مي توان ازكشت سلول استفاده شود.
2-بدست آوردن سلولهاي يكنواخت بطوريكه ديده شده درابتداي هركشت چندين نوع سلول رشد و نمو مييابند ولي چنانچه پاساژهاي متوالي ازهمان كشت داده شود تبدريج وضعيت يكنواختي و همگوني سلولها ديده مي شود كه هموژن شده و بدون شك براي مطالعات تحقيقاتي بسيار مفيد مي باشد.
اگر سلولهاي يكنواخت را درتانك هاي ازت مايع نگاهداري كنيم يكنواختي سلولها حفظ شده و همواره قابل استفاده خواهند بود.
3-صرفه جويي اقتصادي- تزريقات و هزينه نگاهداري حيوانات تحت آزمايش Invitro برتري روش كشت سلول را كاملاً واضح مي نمايد.
3-3-مواردي كه كشت سلول با اشكال مواجه ميشود.
1-استفاده از كارشناسان – به دليل اينكه كشت سلول نياز به مهارت و استفاده از وسايل استريل، مكان مناسب كه عاري از هرگونه آلودگي، رعايت نظم و ترتيب وجود مقررات ويژه در حد بسيار بالا را طلب ميكند اگر امكانات بيان شده فراهم نباشد آلودگيهاي باكتريائي و قارچي تمام مسائل سلولي راتحت الشعاع خود قرارداده و تمام منابع مالي و زحمات تلف خواهد شد از اين نظر افرادي كه دربخش كشت سلول بكار اشتغال دارند بدون استثناء بايستي بكار خود كاملاًوارد و مسلط بركارباشند.
2-نكته دوم اينكه ازنظراقتصادي بايستي انجام كشت سلول به صرفه باشد درغير اينصورت هزينه هاي بالا توجيه پذير نخواهد بود.
3-اگر منظور بررسي سلول خاصي باشدجدانمودن و باصطلاح Isolate يك سلول كار سهل و آساني نيست كه دراجتماع سلولي تشكيل شده بتوان جدا نمود اينكار به شخصي متخصص نيازمند است.
4-به همراه داشتن خصوصيات اوليه. اگر سلول جدا شده خواص اصلي و اوليه خود را ازدست بدهد برگرداندن اين خصوصيات بسيار مشكل و شايد امكان پذير نباشد. لزوماً مارك ثابتي را براي هر سلول درنظر مي گيرند كه درپاساژ هاي مختلف با اين مارك سلول بررسي مي گردد.
5-عدم پايداري. عدم پايداري درسلولهاي زنجيره اي يا سلولهاي Line و كشت متوالي يكي از موارد منفي است كه غالباً با آن روبرو مي شوند وآن بهم خوردن فرم طبيعي كروموزوم ها يا Aneuploid cromosal constitution معروف است و از مواردي است كه بدقت بايستي مورد توجه قرارگيرد.
با آنچه بيان گرديد كليه مطالب كشت سلول در سه قسمت جداگانه تقديم خواهدشد.
الف) كشت سلوهاي اوليه Primary cell culture
ب) كشت سلولهاي ثانويه، ديپلوئيد Seconday cell culture
ج) كشت سلولهاي معلق Supension culture
4-3-كشت سلول اوليه Primary cell culture
بطور كلي به دو روش مي توان سلول اوليه را تهيه نمود. درروش اول قطعه اي از نسج مورد نظر را درمحيط كشت سلول قرار مي دهند تا اينكه سلولهاي تشكيل دهنده آن نسج مهاجرت كرده و تدريجاً به كف ظروف حاوي محيط كشت سلول بچسبد درروش ديگر نسج مورد استفاده را بوسله هضم آنزيمي ويا مكانيكي متلاشي مينمايند بدين ترتيب سلولهاي تشكيل دهنده آن نسج در محيط كشت سلول شناور كشته و درنهايت پس ازچسبيدن به كف ظرف به رشد خود ادامه مي دهند.
سلولهاي اوليه طبيعي معمولاً پس ازشناور شدن درمحيط كشت سلولي به كف ظرف چسبيده و سپس رشد و تزايد حاصل مي نمايند درحالي كه سلولهاي بدست آمده ازنسوج سرطاني مي توانند پس از شناور شدن بصورت معلق تكثير نمايند.
آنزيم هاي معددي جهت هضم و متلاشي نمودن نسوج مختلف بكار مي روند كه عبارتند از تريپسين Collagenase و Pronase وغيره كه گاهي اوقات ازمخلوطي از دو يا چند آنزيم جهت هضم نسوج استفاده مي شود.
تريپسين و پروناز قادر به متلاشي كردن كامل نسوج مي باشند ولي درعين حال به خود سلولها نيز صدمه مي رسانند درحالي كه Collagenase بطور ناقص نسوج را هضم ميكند ولي درعوض به سلولها صدمه كمتري مي رساند.
گرچه به منظور تهيه سلول اوليه ازنسوج مختلف روشهاي گوناگوني وجود دارد ولي درمجموع نكات ذيل بايستي درهمه اين موارد مورد توجه قرارگيرد.
1-چربي ونسوج نكروز شده قبل از هضم آنزيمي بايستي ازنسج جدا و دورريخته شود.
2-نسج مورد نظر بايستي بطور كامل خرد و تكه تكه شود بدون اينكه به سلولهاي تشكيل دهنده آن نسج صدمه زيادي وارد شود.
3-آنزيم هاي بكار رفته جهت هضم نسوج بايستي هرچه سريعتر پس ازاتمام اينكار به وسيله سانترويفوژ كردن خارج شود.
4-تعداد سلولي كه درموقع تهيه كشت سلول اوليه بكار مي رود بيشتر ازسلول مورد لزوم جهت Subculture ميباشد. چرا كه تعدادي ازسلولهاي اوليه دراثر هضم آنزيمي و دستكاريهاي ديگر از بين مي روند.
5-محيط كشت سلولي رشدgroth media جهت تهيه كشت سلول اوليه بايستي كاملاً ازنظر مواد غذايي غني باشد وسعي گردد ازمحيطهاي ساده و فقير استفاده نگرددو سرم مورد مصرف بايستي Fetal calf serum باشد نه سرم گاو و گوساله و اسب.
6-سلولهاي تشكيل دهنده جنين خيلي بهتر و آسانتر از سلولهاي بالغ هضم شده و رشد آنها نيز خيلي بيشتر است.
5-3-جدا نمودن نسج مورد استفاده جهت كشت سلول اوليه
برداشت نسوج ازانسان و ياجنين انسان بايستي با كسب اجازه از خود بيمار و يا وابستگان آن باشد و درمورد حيوانات نيز سعي شود ازآزار و اذيت حيوان حتي المقدور جلوگيري شود سپس محل برداشت آن عضو يا نسج كاملاً با الكل 70% ضد عفوني شده و پس از برداشت آن نسج هرچه سريعتر درتامپون BSS ويا محيط كشت سلول سريعاً به آزمايشگاه انتقال يابد. درصورتي كه بهر دليلي عمل هضم درهمان زمان ممكن نباشد مي توان نسج برداشت شده را دريخچال قرارداده و روز بعد به اينكار اقدام نمود.
6-3-(تهيه كشت سلول اوليه به روش explant)
اين روش تهيه كشت سلول اولين بار به وسيله هاريسون ابداع گرديد و دانشمندان ديگري متعاقب آن روش مذكور را ادامه داده و تكميل نمودند دراين روش قطعه اي از نسج مورد نظر را برداشته و درپلاسماي خون يا لنف غوطه ور مي كنند سپس مقداري سرم خون به آن اضافه مي نمايند وآن را درروي اسلايد (slide) و دراخل Coverslip قرار مي دهند. پلاسماي لخته شده نسج را درخود محكم نگه مي دارد. سرم اضافه شده يا عصاره جنين به عنوان ماده غذايي عمل نموده و سبب مي شوند تا سلولها به تدريج از نسج مهاجرت نموده و جدا شوند و به دنبال آن درسطح شيشه Slide قرار گرفته و روي آن رشد مينمايند. پس ازاينكه سلولها كاملاً از نسج جدا گرديدند نسج مورد نظر را از روي slide برمي دارند تا اينكه سلولها به طور كامل سطح شيشه را بپوشانند روش ذكر شده درحال حاضر كم و بيش درتهيه كشت سلول بكار مي رود ولي رشهاي ديگر بطورعمده جاي آن راگرفته است.
اين روش بيشتر درمورد بيوپسي هاي بدست آمده ازقطعات كوچك پوست و غيره استفاده مي شود چرا كه به روش هضم آنزيمي اين خطر وجود دارد كه دراثر هضم شدن سلولهاي حاصله از دست برود .
عيب ديگر اين روش عبارت است ازرشد سلولهاي گوناگون نسج در سطح شيشه ميباشد كه تفكيك آنها ازيكديگر كارمشكلي است.
7-3-تهيه سلول اوليه به روش آنزيمي
سلولهاي متشكله يك نسج بوسيله گليكوپيتيدهاي گوناگوني به يكديگر چسبيده اند كه بعضي از آنها وابسته به كلسيم بوده ازاين جهت نسبت به مواد شيميايي مانند EDTA حساس مي باشند درون سلولها وروي غشاي خارجي آنها نيز گليكوپروتئينهاي ديگري از قبيل فيبرو نكتين وجود دارد كه نسبت به آنزيم هاي پروتئاز حساس هستند بنابراين به منظور جدانمودن اين سلولها مي توان از تريپسين تنها يا همراه EDTA استفاده نمود. اضافه نمودن پروتئازهاي ديگر نيز مي تواند عمل جداسازي سلول از بافت همبند را انجام دهند. بطور كلي هرقدر خلوص آنزيم بيشتر باشد عمل هضم بهتر انجام شده و به سلول صدمه كمتري وارد مي گردد. با استفاده از روش هضم آنزيمي تعداد سلول بيشتري حاصل مي گردد كه درمدت كوتاهي شامل انواع مختلف سلول موجود در نسج مي باشد. نسوج حاصله ازجنين خيلي بهتر هضم شده و سلولهاي متشكله آن رشد بهتري نسبت به بالغين و تازه متولدين دارد بطوريكه هرقدر سن انسان يا حيواني كه قرار است ازآن سلول تهيه شود بيشتر باشد هضم نسوج مشكلتر بوده و قدرت رشد كمتري نيز دارا مي باشد كه اين پدپده مربوط به افزايش نسج فيبرين موجود بين سلولها مي باشد. و هرقدر زمان هضم آنزيمي بالاتر رود و يااينكه برخورد نسوج خرد شده باديواره ظرف مورد استفاده براي هضم آنزيمي شدت بيشتري داشته باشد سلولهاي بيشتري صدمه ديده و ازبين مي رود.
انتخاب نوع تريپسين نيز اهميت بسياري دارد بطوريكه تريپسين هاي خالصتر سميت كمتري داشته وعمل آن قابل كنترل مي باشد درحالي كه تريپسين هاي ناخالص درعمل هضم بهتري را انجام مي دهند چرا كه دراينگونه تريپسين ها مقدار آنزيم هاي پروتئاز ديگر وجود دارد بنابراين هنگام كار با تريپسين بهتر است ابتداء رقتهاي مختلفي از تريپسين راتهيه نموده و مورد مصرف قرارداد. بدين ترتيب رقت مناسب بدست خواهد آمد.
8-3-هضم آنزيمي به روش تريپسين گرم
دراين روش نسج مورد نظر پس از برداشت ابتدا چربي و پوشش خارجي آن جدا گشته و سپس به وسيله قيچي سركج به قطعات 1 الي 2 ميلي متري درمي آيد. قطعات نسج خرد شده درارلن ماير مخصوص كه داراي فرورفتگي هاي متعددي است جمع آوري شده و بوسيله تامپون PBS سه مرتبه شستشو مي گردد. درمرحله بعد مقدار مناسبي از تريپسين روي نسوج خرد شده اضافه مي گردد و به مدت 20 الي 30 دقيقه همراه با Magnet درروي دستگاه همزن قرار مي گيرد. حرارت لازم جهت هضم نمودن نسوج 36 الي 5/36 درجه سانتيگراد مي باشد و پس از پايان مدت هضم ارلن ماير را برداشته و اجازه مي دهيم قطعات درشت دركف آن رسوب نمايند و مايع روي را كه حاوي سلولهاي هضم شده مي باشد خارج نموده و درظرف ديگري جمع آوري مي نمايند و به آن مقدار سرم استريل اضافه كرده و دريخچال قرار ميدهيم تاعمل هضم متوقف گردد. سپس سلولهاي هضم شده راازصافي هاي پارچه اي عبور ميدهيم تا قطعات درشت و هضم نشده روي صافي پارچه اي مانده و سلوهاي هضم شده ازصافي عبور نمايند. مايع حاصله از اين قسمت را دردور كم سانتريفوژ مي نمائيم بطوريكه سلولهاي جد اشده دركف لوله جمع آوري گشته و مايع فوقاني راكه حاوي تريپسين مي باشد دور مي ريزيم.
رسوب حاصله ازهضم راه همان سلولهاي اوليه مي باشند درمحيط كشت سلولي رشد growth media باكمك پي پت حل مي كنيم بطوريكه تعداد تقريبي سلول دراين مرحله 105 سلول درهر سانيمتر مكعب باشد . نظربه اينكه تعداد زيادي از اين سلولهاي بدست آمده به علت هضم آنزيمي ازبين رفته اند شمارش دقيق سلولي دراين مرحله ارزش زيادي ندارد.
روش هضم آنزيمي ذكر شده جهت بدست آوردن تعدادي زيادي سلول درزمان كوتاه مناسب است. دراين روش بايستي سعي نمود حتي المقدور ازنسوج جوان يا سنين پائين تر استفاده گردد.
9-3-هضم آنزيمي به روش تريپسين سرد
يكي از عيوب روش تريپسين گرم اين است كه تماس چند ساعته تريپسين باسلوهاي نسج درحرارت 5/36 درجه سانتي گراد سبب ازبين رفتن تعداد قابل توجهي ازسلوها مي گيرد. بنابراين روش ديگري كه براي جلوگيري ازبين رفتن سلولها وجود دارد عبارتست از قراردادن نسج درتريپسين بمدت طولاني و دريخچال مي باشد كه اين عمل سبب تضعيف اثر آنزيم شده و با نفوذ به زواياي نسج مورد نظر درمدت كوتاهتري مي توان نسج را هضم نمود.
دراين روش پس ازخرد كردن نسج آن را به مدت 18-16 ساعت همراه با تريپسين دريخچال قرار مي دهند سپس آنرا ازيخچال خارج نموده و با كمك پيپت و يا هر وسيله مشابه ديگر به سهولت نسج را متلاشي مي نمايند و بقيه مراحل آن مشابه روش تريپسين گرم است.
با استفاده از روش ترپسين سرد تعداد بيشتري سلول بدست آمده و قدرت زنده ماندن آنها نيز نسبت به روش گرم بهتر است. اين روش با توجه به اينكه نياز زيادي به هم زدن و سانتريفوژ كردن هاي مكرر ندارد نسبت به روش هضم با تريپسين گرم ارحج تر است ولي طول زمان آن بيشتر مي باشد. درصورتيكه حجم نسوج مورد استفاده براي تهيه سلول زياد باشد روش هضم سرد مناسب نمي باشد ولي درصورت نياز به قطعات كوچك روش سرد كاربرد زيادتري دارد.
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.