پایان نامه تاثیر استرس تاریکی و سرما روی برخی پارامترهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی یونجه(Medicago sativa) و خارشتر(Alhaji camelorum)
فهرست
چکیده …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 1
فصل اول
1،1- استرس ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 3
1،2- تنش دما ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 3
1،3- استرس دما ………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 4
1،4- تغییرات فیزیولوژیکی و بیو شیمیایی گیاه در پاسخ به سرما …………………………………………………………………………… 5
1،4،1- اثر استرس سرما بر فعالیت پروتئین ها …………………………………………………………………………………………………….. 5
1،4،2- اثر اسرس سرما روی میزان قندهای محلول و نشاسته ……………………………………………………………………………….. 5
1،4،3- تغییر غشاها و پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی ………………………………………………………………………………………….. 6
1،4،4- اثر استرس سرما بر انباشت پرولین ………………………………………………………………………………………………………….. 6
1،4،5- اثر استرس سرما بر کاهش محتوای نسبی آب (RWC) ……………………………………………………………………………… 7
1،4،6- اثر استرس سرما بر تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS) …………………………………………………………………………. 7
1،4،7- اثر استرس سرما بر تغییر بیان ژنها …………………………………………………………………………………………………………… 8
معرفی گیاه خارشتر …………………………………………………………………………………………………………………………………………… 9
معرفی گیاه یونجه …………………………………………………………………………………………………………………………………………… 10
فصل دوم : مواد و روشها
2،الف) شرایط و نحوه ی کشت دانه های گیاه یونجه …………………………………………………………………………………………. 11
2،ب) شرایط و نحوه ی کاشت دانه های گیاه خارشتر ……………………………………………………………………………………….. 11
2،ج) اعمال تیمارها ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 12
2،د) سنجش فاکتورهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی …………………………………………………………………………………………… 12
2،د) 1- اندازه گیری میزان پروتئین های محلول ریشه و اندام هوایی …………………………………………………………………… 12
2،د) 2- تعیین میزان قندهای محلول ریشه و اندام هوایی ……………………………………………………………………………………. 13
2،د) 3- تعیین میزان مالون دی آلدهید (MDA) ………………………………………………………………………………………………… 14
2،د) 4- تعیین میزان رنگیزه های فتوسنتزی ………………………………………………………………………………………………………. 14
2،د) 5- تعیین میزان پرولین اندام هوایی و ریشه ……………………………………………………………………………………………….. 15
2،د) 6- تعیین محتوای نسبی آب (RWC) اندام هوایی ………………………………………………………………………………………. 15
2،د) 7- تهیه عصاره ی گیاهی برای اندازه گیری فعالیت آنزیم ها ……………………………………………………………………….. 15
2،د) 8- اندازه گیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز ریشه و اندام هوایی ………………………………………………………. 16
2،د) 9- اندازه گیری فعالیت آنزیم گایاکل پراکسیداز (GRX) ……………………………………………………………………………… 16
2،د) 10- اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) ……………………………………………………………………………………………. 17
2،د) 11- الکتروفورز پروتئین با SDS – PAGE ……………………………………………………………………………………………….. 17
2،د) 12- دستگاه الکتروفورز …………………………………………………………………………………………………………………………… 22
2،د) 13- بررسی باندهای پروتئینی ………………………………………………………………………………………………………………….. 22
2،د) 14- آنالیز آماری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 22
فصل سوم : نتایج
3،1- پروتئین های محلول کل …………………………………………………………………………………………………………………………. 23
3،2- تغییر میزان قندهای محلول ……………………………………………………………………………………………………………………… 27
3،3- تغییر میزان نشاسته …………………………………………………………………………………………………………………………………. 30
3،4- تغییر میزان مالون دی آلدهید (MDA) ……………………………………………………………………………………………………… 32
3،5- تغییر میزان رنگیزه های فتوسنتزی ……………………………………………………………………………………………………………. 34
3،6- تغییر میزان پرولین ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 36
3،7- تغییر محتوای نسبی آب (RWC) …………………………………………………………………………………………………………….. 38
3،8- تغییر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) ………………………………………………………………………………………. 39
3،9- تغییر فعالیت آنزیم گایاکل پراکسیداز (GPX) ……………………………………………………………………………………………. 41
3،10- تغییر فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) ………………………………………………………………………………………………………….. 43
3،11- تغییر طول اندام هوایی و ریشه ………………………………………………………………………………………………………………. 45
3،12- نسبت طول اندام هوایی ………………………………………………………………………………………………….. 47
3،13- الکتروفورز پروتئین ………………………………………………………………………………………………………………………………. 48
فصل چهارم : بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 51
فصل پنجم :پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………. 57
فصل ششم: پیوست ها……………………………………………………………………………………………………………………………………. 58
فصل هفتم: فهرست منابع ………………………………………………………………………………………………………………………………… 63
فهرست شکل ها
شکل 1- الکتروفورز ژل (SDS – PAGE) پروتئین های اندام هوایی و ریشه خارشتر …………………………………………… 49
شکل 2- الکتروفورز ژل (SDS – PAGE) پروتئین های اندام هوایی و ریشه یونجه ……………………………………………… 50
فهرست نمودارها
نمودار 1- تغییرات میزان پروتئین های کل ریشه های یونجه و خارشتر ……………………………………………………………….. 23
نمودار 2- تغییرات میزان پروتئین های کل اندام هوایی یونجه و خارشتر ……………………………………………………………… 24
نمودار 3- تغییرات میزان پروتئین های محلول کل در دانه گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………. 24
نمودار 4- تغییرات میزان پروتئین های محلول کل در ریشه های گیاهان یونجه و خارشتر ……………………………………… 25
نمودار 5- تغییرات میزان پروتئین های محلول کل در ریشه های یونجه و خارشتر ………………………………………………… 26
نمودار 6- تغییرات میزان قندهای محلول کل در ریشه گیاهان یونجه و خارشتر ……………………………………………………. 27
نمودار 7- تغییرات میزان قندهای محلول کل در اندام هوایی یونجه و خارشتر ……………………………………………………… 28
نمودار 8- تغییرات میزان قندهای محلول کل در دانه های گیاهان یونجه و خارشتر ……………………………………………….. 29
نمودار 9- تغییرات میزان نشاسته در ریشه گیاهان یونجه و خارشتر ……………………………………………………………………… 30
نمودار 10- تغییرات میزان نشاسته در اندام هوایی گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………………….. 31
نمودار 11- تغییرات میزان MDA در ریشه گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………………………… 32
نمودار 12- تغییرات میزان MDA در اندام هوایی گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………………….. 33
نمودار 13- تغییرات میزان کلروفیل a در برگهای گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………………… 34
نمودار 14- تغییرات میزان کلروفیل b در برگهای گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………………… 35
نمودار 15- تغییرات میزان کاروتنوئید در برگهای گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………………… 35
نمودار 16- تغییرات میزان پرولین در ریشه گیاهان یونجه و خارشتر ……………………………………………………………………. 36
نمودار 17- تغییرات میزان پرولین در اندام هوایی گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………………… 37
نمودار 18- تغییرات محتوای نسبی آب در گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………………………….. 38
نمودار 19- تغییرات میزان فعالیت APX در ریشه گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………………….. 39
نمودار 20- تغییرات میزان فعالیت APX در اندام هوایی گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………. 40
نمودار 21- تغییرات میزان فعالیت GPX در ریشه گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………………….. 41
نمودار 22- تغییرات میزان فعالیت GPX در اندام هوایی گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………. 42
نمودار 23- تغییرات میزان فعالیت CAT در ریشه گیاهان یونجه و خارشتر …………………………………………………………… 43
نمودار 24- تغییرات میزان فعالیت CAT در اندام هوایی گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………….. 44
نمودار 25- تغییرات طول ریشه در گیاهان یونجه و خارشتر ……………………………………………………………………………….. 45
نمودار 26- تغییرات طول اندام هوایی در گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………………………………. 46
نمودار 27- تغییرات نسبت طول اندام هوایی به ریشه در گیاهان یونجه و خارشتر ………………………………………………… 47
چکیده :
تنش سرما یکی از استرسهای اکسیداتیو محیطی می باشد که منجر به بروز تغییراتی اعم از فیزیولوژیکی ، مورفولوژیکی و بیو شیمیایی در سلول و در مجموع در گیاه می گردد . این تنش یکی از عوامل محدود کننده رشد و محصول دهی و پراکنش گیاهان می باشد . دماهای پایین فعالیتهای بیو سنتزی و بیو شیمیایی را در گیاهان کاهش می دهد و فرآیندهای فیزیولوژیکی طبیعی گیاه را محدود می نماید . سرما باعث تولید گونه های فعال اکسیژن مانند سوپراکسید ، پراکسید هیدروژن و رادیکال هیدروکسیل در اندامکهای مختلف سلول شده که هر کدام با برهمکنش با مولکول ها و ماکرومولکولها باعث ایجاد تغییراتی در متابولیسم سلول و نهایتاً در گیاه می شود . در پروژه حاضر تلاش شده اثر این استرس روی گیاه خارشتر و یونجه بصوررت مقایسه ای بررسی گردد . دو گیاه نامبرده شده ، گیاهانی از خانواده ی پروانه آساها می باشند که جزء علوفه دامی محسوب می شوند و در شرایط مختلف آب و هوایی توان رشد و محصول دهی دارند و نسبت به سرما مقاوم می باشند .
در انجام این پروژه دو هدف کلی پیگیری شده است : یکی بررسی و شناسایی مکانیسم های مقاوم شدن این گیاهان نسبت به دماهای پایین و استفاده از این سازو کارها در مورد گیاهان زراعی حساس به سرما و بهسازی آنها می باشد و دیگری مقایسه ی ویژگیهای گیاه خارشتر و یونجه از نظر محتوای غذایی و سیستم دفاعی در برابر شرایط محیطی می باشد .
در کار حاضر گیاهان 45 روزه ی یونجه و خارشتر که در شرایط آزمایشگاهی کشت داده شده بودند به دمای 8 درجه سانتیگراد منتقل شدند و به مدت 24 ساعت در این دما و شرایط تاریکی قرار گرفتند . بعد از این مدت به همراه گروه شاهد در سه تکرار نمونه برداری انجام گردید .
برخی فاکتورهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی از جمله فعالیت چند آنزیم آنتی اکسیدانت مثل کاتالاز ، گایاکل پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز ، میزان مالون دی آلدئید ، میزان قندهای محلول ، میزان پروتئین های محلول ، محتوای نسبی آب ، میزان کلروفیل a و b و کاروتنوئیدها ، میزان پرولین و میزان پروتئین های DLP ریشه و اندام هوایی این دو گیاه توسط الکتروفورز اندازه گیری شد .
در کل مشاهد ه گردید که گیاه خارشتر از نظر ذخیره ی پروتئینی و مواد قندی در بخش های مختلف پیکر گیاه و دانه ها در سطوحی نزدیک به گیاه یونجه می باشد و این گیاه از نظر سیستم آنتی اکسیدانتی قوی تر از یونجه بوده و در مقابل استرس سرما میزان تخریب رنگیزه ها در گیاه خارشتر کمتر از یونجه می باشد و در کل توانایی مقاومت خارشتر در برابر دمای 8 درجه سانتیگراد بیشتر از یونجه بوده که این یک فاکتور مهم در زندگی گیاه خارشتر می باشد . لذا این گیاه در مناطق سردسیر و سرزمین های کوهپایه ای با خاکهای فقیر و کم آب قدرت رشد داشته و می تواند به عنوان گیاه علوفه ای برای تغذیه ی دامها باشد و به اندازه ی گیاه یونجه بلکه حتی بیشتر از این گیاه در پرورش دامها و تغذیه ی آنها و رونق دامداری در کشور مؤثر واقع گردد .
فصل اول : مقدمه
1،1) استرس : Levitt پیشنهاد کرد که تنش بیولوژیکی عبارت است از هر نوع شرایط محیطی که ممکن است رشد و نمو و فعالیت طبیعی گیاه را کاهش دهد و بر این اساس دو نوع پاسخ را در موجودات زنده و در مقابل عوامل تنش زا تشخیص داد :
1) اجتناب یا دوری گزیدن از تنش Stress Avoidance
2) تحمل تنش Stress Tolerance
در حالت اجتناب از تنش ، موجود زنده به گونه ای واکنش می دهد که کارکرد عامل ایجاد تنش را کاهش می دهد . برای مثال یک گیاه در صحرا یا بیابان با گسترش سیستم ریشه ای خود به سمت پایین و در جهت آبهای زیر زمینی می تواند از خشکی اجتناب و دوری کند . از سوی دیگر اگر گیاه در مقابل تنش شیوه تحمل را انتخاب کرده باشد ، در چنین حالتی گیاه می تواند به آسانی عامل تنش زا را تحمل کند . مثلاً در چاودار گیاه با سنتز پروتئین های ضد انجماد در مقابل یخ زدگی مقاومت می کند(Levitt J.,1980) (36) .
1،2) تنش دما Temperature Stress
یکی از عواملی که بر روی رشد گیاه تاثیر دارد ، درجه حرارت است ؛ زیرا فعالیت های فیزیولوژیکی که شامل فرآیندهای آنزیمی و بیوشیمیایی می شود از دمای محیط تاثیر می پذیرد . گیاهان موجوداتی هستند که دمای ثابتی ندارند (Poikilothermic) یعنی از دمای محیط تبعیت می کنند و میزان تاثیر پذیری آنها به گونه گیاهی و میزان مقاومت آنها نسبت به یخ زدگی بستگی دارد . آسیب ناشی از یخبندان و سرما زدگی در گیاهان زراعی و علوفه ای در هر نقطه ای از جهان خطر محسوب می شود . تغییر جزئی در درجه حرارت محیط می تواند اثرات زیادی بر روی میزان محصول داشته باشد . به عنوان مثال اگر بتوان مقاومت گیاهان را به سرما به اندازه ی 2 درجه سانتیگراد افزایش داد ، تولید محصولات زراعی به طور قابل توجهی افزایش خواهد یافت .
امروزه تلاش می شود تا با بررسی گیاهان مقاوم به سرما و شناسایی و تقویت مکانیسم های مقاومت ساز آنها و تعمیم این مکانیسم ها به گیاهان زراعی حساس به سرما ، اینها را نسبت به استرس دمایی مقاوم ساخت .
اثرات تنش حرارتی را کلاً به سه دسته تقسیم می کنند :
- Chilling stress
- Freezing stress
- High Temperature stress
1،3) استرس سرما Chilling stress
دمای پایین یکی از مهمترین عوامل غیر زنده محدود کننده رشد ، محصول دهی و پراکنش گیاهان محسوب می شود (11) . دمای پایین فعالیت بیو سنتزی گیاهان را کاهش می دهد ، فرآیندهای فیزیولوژیکی طبیعی را محدود می کند و ممکن است باعث بروز آسیب های همیشگی در گیاه شود که نهایتاً منجر به مرگ گیاه خواهند شد . گونه های مختلف گیاهی توانایی های متفاوتی برای تحمل دمای پایین دارند . گونه های گرمسیری حساس به سرما حتی با دماهای پایین غیرانجمادی ، صدمات فراوانی می بینند . این صدمات از اختلالات فرآیندهای متابولیکی و سلولی تا تغییر خصوصیات غشاها را شامل می شوند(Dubios M.,1988) (23) .
صدمه سرمایی ممکن است در درجه حرارت های زیر 15 درجه سانتیگراد رخ دهد اما در تعریف ، سرمازدگی در غیاب بلورهای یخ در سلول گیاهی در درجه حرارت بین صفر تا 15 درجه اتفاق می افتد . در اکثر گیاهان هنگامی که دما به 10 درجه بالای صفر می رسد صدمات زیر قابل مشاهده است :
نکروزیس ، کاهش رشد ، کاهش تولید دانه ، کمرنگ شدن برگها ، کاهش قدرت جوانه زنی دانه ها ، کاهش فتو سنتز و کاهش آب .
در مورد سرما ، عامل اصلی آسیب وارد شده به گیاه از آب گیری یا دهیدراتاسیون ناشی نمی شود بلکه تغییر فاز در چربی های غشا عامل اصلی صدمه زننده به سلول می باشد (33) . در این حالت غشایی که دارای انعطاف پذیری و سیالیت است ، این حالت را از دست می دهد و به حالت جامد در می آید (غیر قابل انعطاف) در این تغییر ماهیت
ساختمانی و نظم مولکولی غشا به هم خورده و کلیه فعالیت های غشا و مولکولهای پروتئین و آنزیم ها تغییر شکل می دهند .
1،4) تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه در پاسخ به سرما
تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی فراوانی در داخل گیاه در پاسخ به دماهای پایین رخ می دهد . جریانات یون کلسیم در طی چند ثانیه پس از انتقال گیاهان به سرما گزارش شده است (49) و تغییرات در فسفریلاسیون پروتئین در طی چند دقیقه پس از انتقال قابل مشاهده است (45) . و بالاخره چند ساعت پس از انتقال به سرما ، بیان ژنها عوض می شود که شامل انباشت mRNA (29) و تغییر فعالیت آنزیمی (27) می باشد . محتوای آب نسبی کاهش می یابد و تغییرات ساختاری مثل افزایش ضخامت برگی نیز در طی چند روز تا چند هفته مشاهده می شود (53) . در طی سازگاری به سرما ، میزان قندهای محلول و نشاسته (53) و پروتئین (77) افزایش می یابد .
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.